原代细胞培养技术汇总

原代细胞培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。

但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。最常用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。

原代细胞培养技术方法都有哪几种？

1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。

2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。

3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。

4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至（1-10）×106/ml。

5、将悬液分至冻存管中，每管1ml。

6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。

7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。

8、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→超低温冰箱（—80℃过夜）→液氮。

1、取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。

2、吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。

3、1000r/分钟离心5分钟，去除上清。

4、用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2培养箱静置培养。

镜检细胞贴壁能力。次日更换一次培养液，继续培养。

一．台盼蓝染色

1、制备单个细胞悬液，并作适当稀释（106细胞/ml)。

2、染色：取9滴细胞悬液移入小试管中，加一滴0.4%台盼蓝溶液，混匀。

3、计数：在3分钟内，用血球计数板分别计数活细胞和死细胞。

4、镜下观察，死细胞被染成蓝色，而活细胞拒染。

5、按公式计算细胞活力。

二．伊红Y染色

1、制备1×106-5×106细胞／ml的细胞悬液。

2、取0.1ml细胞悬液加0.1ml伊红Y染液混合。

3、用计数板镜下计数活、死细胞数。

4、镜下观察，着红色的为死细胞。按公式计算细胞活力。

三．苯胺黑染色实验

1、制备1×106-5×106细胞／ml的细胞悬液。

2、将1份1%苯胺黑溶液与含血清生理盐水作1：9混合稀释，使其成0.1%苯胺黑染液。

3、取0.1ml细胞悬液加0.1ml苯胺黑染液混合。室温放置10分钟。

4、用计数板镜下计数 ，黑色细胞为死细胞，按公式计算活细胞率。

1、准备计数板：用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后轻轻拭干。

2、制备细胞悬液：用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。要求细胞密度不低于104/ml，若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，2分钟），重悬浮于少量培养液中。

3、加样：用习惯轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。

4、计数：计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000。