培养条件对纳豆芽孢杆菌芽孢形成的影响

    纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)是从日本传统食品中分离出来的芽孢杆菌，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种[1]。纳豆芽孢杆菌能产生具有溶纤活性的纳豆激酶[2],其芽孢能耐酸碱、耐高温(100℃)及耐挤压，在饲料制粒过程及酸性胃环境中均能保持高度的稳定性；在肠道中不增殖，只在肠道上段迅速发育转变成代谢活跃的营养型细胞[3]，增强以厌氧菌为优势菌群的肠道正常菌群的生长，促进动物对营养物质的吸收，增强机体的免疫功能[4]。体外试验研究表明，添加纳豆芽孢杆菌能使肠道酸化而有利于铁、钙及维生素D等的吸收，促进动物生长，缩短饲养周期，同时纳豆芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，能降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，从而提高饲料的转化率并增加饲料的可利用种类[5]。动物饲养试验结果表明[6，7]，在仔猪前、后期日粮中添加纳豆芽孢杆菌能明显提高仔猪生长性能和饲料转化率，经济效益显著；日粮中添加适宜用量的纳豆芽孢杆菌能提高鸡十二指肠消化酶的活力，显著提高肉仔鸡生长性能。因此，纳豆芽孢杆菌是一种较好的微生物饲料添加剂，目前在家畜及水产养殖中的应用日益扩大。 

    由于纳豆芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保藏，复活率高，是制备纳豆芽孢杆菌制剂的理想存在形式。因此，获得高浓度、高活性的芽孢是制备纳豆芽孢杆菌制剂的关键。目前，国内对纳豆芽孢杆菌的研究大多集中于纳豆固体培养、纳豆激酶，液体深层培养研究也以收获营养活菌体为目的，在其芽孢形成方面的研究不多。因此，本文旨在通过对影响纳豆芽孢杆菌液体培养形成芽孢的营养条件、pH值、接种量、溶氧水平方面进行研究，为纳豆芽孢杆菌芽孢制剂的产业化生产提供参考。 

1 材料 

1.1 微生物菌种 

    纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）JS-NDT-05，由江苏省微生物研究所选育、分离纯化和保藏。 

1.2 试剂 

    乳糖、蔗糖、麦芽糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆粉、酵母粉均为国产生化试剂；尿素、葡萄糖、NH4Cl、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、CaCO3为国产分析纯试剂；玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉、红薯淀粉、鱼粉、大豆粉、大豆饼粉、花生饼粉均为市售。 

1.3 培养基 

1.3.1 斜面种子培养基 

    BPY培养基[8]：牛肉膏5g/l、酵母膏5g/l、蛋白胨10g/l、葡萄糖5g/l、NaCl 5g/l、琼脂15～20g/l、蒸馏水1L，pH值7.2。 

1.3.2 摇瓶培养基 

    根据试验需要配制培养基或在基础培养基中添加C源、N源或无机盐配制培养基。C源基础培养基: 酵母膏3g/l、蛋白胨10g/l、NaCl 5g/l，pH值7.2～7.4；N源基础培养基: 葡萄糖5g/l、NaCl 5g/l，pH值7.2～7.4。 

1.3.3 活菌及芽孢检测用培养基 

    营养琼脂（NA）培养基[9]。 

1.4 器材 

    pH计(梅特勒-托利多Delta320pH)、HYG-11a迥旋式恒温调速摇瓶柜(上海欣蕊自动化设备有限公司)、自动发酵罐(B.BRAUN BIOSTAT C15-3)、721分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。 

2 方法 

2.1 培养方法 

2.1.1 种子培养 

    用接种针从菌种斜面上沾取少量菌泥，划线接种于BPY培养基，37℃培养18～24h，镜检以芽孢为主即成熟。 

2.1.2 摇瓶培养 

    将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来，放入内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡，制成均匀的菌悬液，80℃水浴加热10min，以2%(v/v)的接种量接入孢子悬液，摇瓶装量10%～20%(v/v)，在37℃条件下，200～220r/min的迥摇培养20～48h。 

2.1.3 15L自动发酵罐培养 

    发酵罐装液量70％～80%(v/v)，将成熟的斜面种子菌悬液经80℃水浴加热10min后，接入15L自动发酵罐，37℃培养24h左右，搅拌转速300～450r/min, 通气量4.0L/min。培养过程中pH值、溶氧水平可根据实验需要进行电脑自动控制和监测。 

2.2 测定方法  

    pH值测定用梅特勒-托利多Delta320pH 计测定；活菌总数计数采用周佳庆介绍的方法[10]；芽孢平板计数是在80℃水浴加热15 min后，采用平板菌落计数法检测芽孢的生成量[11]；芽孢染色法观察芽孢[10]；芽孢率是指样品按活菌总数计数、芽孢平板计数分别计数活菌总数和芽孢数，计算公式为： 

    芽孢率（%）=（芽孢数/活菌总数）×100%。 

3 结果与讨论 

3.1 C源对芽孢形成的影响 

    在培养基成分中，碳源及其浓度是影响芽孢形成的主要因素[12-15],在C源基础培养基中分别添加不同C源，即：玉米淀粉20g/l、小麦淀粉20g/l、木薯淀粉20g/l、红薯淀粉20g/l、乳糖5g/l、蔗糖5g/l、麦芽糖5g/l、葡萄糖5g/l，配制培养基，250ml三角瓶分装培养基50ml，进行纳豆芽孢杆菌的摇瓶培养，结果如表1所示。 

    实验结果表明：纳豆芽孢杆菌JS-NDT-05具有良好的淀粉酶活性，能直接利用淀粉且生长良好。与葡萄糖、乳糖等速效碳源相比较，在玉米淀粉、小麦淀粉等淀粉类长效碳源中，菌体生长较慢，14～16h时生长进入平衡期，比葡萄糖、乳糖等速效碳源晚2～6h。在芽孢形成方面，淀粉类碳源的芽孢形成极缓慢，培养24h左右镜检，除木薯淀粉、红薯淀粉培养基中有少数菌体开始形成芽孢外，玉米淀粉和小麦淀粉培养基中的菌体均呈营养体形态，未形成芽孢，延长培养时间至40h, 木薯淀粉、红薯淀粉分别有93.5%、90%的菌体形成了芽孢，而玉米淀粉和小麦淀粉则不理想；而在葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖培养基中，菌体在10h左右生长进入平衡期后即开始形成芽孢，培养24h，除麦芽糖芽孢形成不理想外，葡萄糖、乳糖、蔗糖均已有90%以上的菌体形成了芽孢。从总体看来，玉米淀粉的营养菌体数量最多，但不利于芽孢形成；木薯淀粉芽孢形成数量最高，葡萄糖次之，两者的芽孢形成率相近，但所需培养时间不同，木薯淀粉需40h，而葡萄糖只要24h。因此，葡萄糖对纳豆芽孢杆菌的芽孢形成最适宜。 

    在C源基础培养基中，以葡萄糖为C源，配制含不同葡萄糖浓度的培养基， 250ml三角瓶分装培养基25ml，进行摇瓶培养，考察葡萄糖浓度对纳豆芽孢杆菌JS-NDT-05芽孢形成的影响，结果如图1所示。 

    实验结果表明：随着葡萄糖浓度的提高，活菌数和芽孢数都呈先升后降变化趋势，芽孢形成率总体呈下降趋势，在葡萄糖浓度达15g/l时，活菌数及芽孢数达峰值。当葡萄糖浓度在0～15g/l范围内变化时，芽孢形成率变化不大，均在97%以上，说明提高葡萄糖浓度能提高芽孢浓度。当葡萄糖浓度超过15g/l时，不仅芽孢形成率明显下降，而且活菌数和芽孢数也下降至葡萄糖浓度为5g/l时的水平。这可能是由于菌体利用葡萄糖生长时，产生酸性代谢物，葡萄糖浓度越高，生长对数期的pH值就越低，起始葡萄糖浓度超过15g/l后，生长对数期pH值均低于5，菌体代谢改变，生长和芽孢形成受抑制。因此，为了在提高菌体浓度的同时，维持较高的芽孢形成率，提高最终收获的芽孢数，必须控制葡萄糖浓度，葡萄糖的起始浓度控制在15g/l，对芽孢形成最适宜。 

3.2 N源对芽孢形成的影响 

    培养基中氮源也影响芽孢的形成[13]。在N源基础培养基中分别添加有机氮源，如蛋白胨、酵母膏、玉米浆粉、大豆粉、大豆饼粉、花生饼粉、鱼粉和酵母粉各10g/l及无机氮源，如尿素、NH4Cl和（NH4）2SO4各20g/l，配制培养基，250ml三角瓶分装培养基25ml ，进行摇瓶培养，考察不同N源对纳豆芽孢杆菌JS-NDT-05芽孢形成的影响，结果如图2所示。 

    实验结果表明：纳豆芽孢杆菌 JS-NDT-05的生长有机氮源适宜，在以无机氮为唯一氮源时，生长弱，芽孢难以形成，此结果与陈丽花等[16]的部分研究结果相同。在有机氮源中除酵母粉外，芽孢形成率均能达98%以上，芽孢数量从高到低依次为酵母膏、蛋白胨、玉米浆粉、花生饼粉、大豆饼粉、鱼粉、大豆粉。玉米浆粉、花生饼粉、大豆饼粉为工业副产物，价格较低廉，是低成本工业化大规模培养芽孢的优选N源。因此，以下实验中的N源均采用大豆饼粉。 

3.3 无机盐 

    在纳豆芽孢杆菌液体深层培养时，培养基组成中以NaCl为唯一无机盐，获得的菌体量高[16]，为了在提高活菌数的同时，提高芽孢数量，以葡萄糖5g/l、大豆饼粉10g/l、NaCl 5g/l为对照，再分别添加无机盐：CaCO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4各3g/l；KH2PO4 1g/l+K2HPO4 3g/l，配制培养基，250ml三角瓶分装培养基25ml ，进行摇瓶培养23h，考察不同无机盐对纳豆芽孢杆菌 JS-NDT-05芽孢形成的影响，结果如表2所示。 

    实验结果表明：添加CaCO3，芽孢形成率高，但不利于活菌数量和芽孢数量的提高； MgSO4·7H2O利于菌体的生长，但不利于芽孢形成，芽孢形成率较低；分别添加KH2PO4和K2HPO4，对菌体生长和芽孢形成情况与NaCl相似，但同时添加则促进菌体生长，显著提高活菌数，但强烈抑制芽孢的形成。由于添加KH2PO4后活菌数、芽孢数量和芽孢形成率均有所提高，因此，后续实验用培养基中无机盐除NaCl外，添加KH2PO4。 

    Mn作为一种微生物生长所需的微量元素，是超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖异构酶等许多酶的辅助因子，对活菌数和芽孢形成有影响[17，18]。因此，按上述实验获得的最适C源、N源及无机盐组成配制培养基，即葡萄糖15g/l、大豆饼粉10g/l、KH2PO4 3g/l、NaCl 5g/l，添加不同浓度的MnSO4·H2O使Mn2+浓度分别为:0、1.2、2.4、3.5、4.7、5.9、7.1mmol/l，考察Mn2+浓度对芽孢形成的影响，结果如图3所示。 

    实验结果表明:Mn2+对菌体生长有促进作用，营养菌体数量和芽孢数量随着Mn2+浓度的提高而提高，但芽孢形成率则在Mn2+浓度为1.2～2.4mmol/l(即MnSO4· H2O 0.2～0.4g/l)时达98%以上，随后呈下降趋势，当Mn2+浓度达7.1mmol/l时对芽孢的形成产生显著抑制。因此, 在获得较高菌体量同时,还要求保持理想的芽孢形成率,则Mn2+浓度为2.4mmol/l(即MnSO4·H2O 0.4g/l)时最适宜。 

3.4 pH值对芽孢形成的影响 

    如前述以最适C源、N源及无机盐配制培养基，接种前用无菌NaOH或HCl调整起始pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，250ml三角瓶分装培养基25ml，进行摇瓶培养，考察起始pH值对Bacillus natto JS-NDT-05芽孢形成的影响，结果如图4所示。 

    实验结果表明:从菌体生长数量来看，起始pH值7～7.5最适宜，但对芽孢形成率来说，起始pH值6.5～7.0最适宜，因此，pH值7.0是最适宜的起始pH值。 

3.5 接种量对芽孢形成的影响 

    250ml三角瓶分装培养基25ml，接种Bacillus natto JS-NDT-05芽孢，使摇瓶中芽孢数量分别为104、105、106、107数量级，进行摇瓶培养24h，考察接种量对芽孢形成的影响，结果如表3所示。 

    实验结果表明：收获的芽孢数量随着接种量的提高而提高，低接种量表现出很高的孢子增长倍率,但不能够获得较高的芽孢数量,最高接种量能收获最大孢子数量，但孢子增长倍率最低,因此，控制芽孢接种量，起始使芽孢浓度在106个/ml数量级最适宜。 

3.6 溶氧水平对芽孢形成的影响 

    氧气是影响芽孢形成的一个重要因素，不同的菌株形成芽孢所需的供氧条件不同。Mohamed Ismall等[19]研究过球形芽孢杆菌溶解氧与芽孢形成的关系，发现随着溶解氧浓度升高，芽孢形成率也越高，但有的学者却得出了相反的结论[20]。为了考察溶氧对纳豆芽孢杆菌JS-NDT-05芽孢形成的影响，在250ml三角瓶中分别装培养基25ml、50ml，进行摇瓶培养24h，结果如图5所示。 

    实验结果表明:通气量大（通气时间长），溶氧水平高，有利于菌体的生长、芽孢的形成和后期芽孢活性的保持。比较摇瓶装量25/250ml和50/250ml，在菌体生长前期，两者相似，进入对数生长期后，供氧对菌体生长影响显著，通气量大的25/250ml装量菌体生长快，活菌数量高，芽孢形成早，芽孢数量高，而供氧水平低的50/250ml装量菌体生长慢，平衡期短，菌体易衰老，芽孢形成率最高仅为80%左右且芽孢极易失活。由于摇瓶培养不便于监测培养基中的溶氧变化，因此,在15L自动发酵罐中分别进行不控制溶氧水平、用搅拌转速和通气量控制溶氧水平不低于30%的实验，对培养过程进行观察,进一步考察溶氧对菌体生长和芽孢形成的影响，结果如图6所示。 

    观察比较不控制溶氧水平和控制溶氧水平两个培养过程，从图6可以看出：菌体进入对数生长期后,快速消耗氧气，若不通过调整搅拌转速或通气量进行溶氧水平的调控，则培养基中溶氧水平可降至0%，时间长达4h，此时菌体处于厌氧生长，菌体生长减缓，而在控制溶氧水平的罐批中菌体的生长不受影响，生长速度快，生长量高，9h左右就已结束对数生长期，进入平衡期。从对数生长中后期开始,菌体生长减缓，耗氧减少，溶氧逐步回升。在芽孢形成方面,在以芽孢方式接种后，由于芽孢萌发，两个罐批的芽孢率均急剧下降，当菌体结束迟滞期时芽孢率几乎降至为0%，在平衡期的中后期，菌体开始形成芽孢。由于控制溶氧水平的罐批，菌体生长快，生长量多，芽孢形成也快，且芽孢数量也多，20h芽孢数可达7.7×109个/ml。就最终芽孢形成率来说,两个罐批的结果相似,均在98%以上。 

4 小结  

    芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆休眠体，并非细菌生活史不可缺少的部分,它的形成受营养物质和环境因素的影响。本文考察了营养条件、pH值、接种量、溶氧水平方面对纳豆芽孢杆菌JS-NDT-05液体培养形成芽孢的影响。在营养条件方面,纳豆芽孢杆菌JS-NDT-05具有淀粉酶活性,能直接利用淀粉类C源,且与葡萄糖、蔗糖等速效碳源在菌体生长方面相似,但芽孢形成缓慢。玉米淀粉最适宜菌体生长，能提高营养活菌的数量,但不利于芽孢形成。就芽孢形成来说,木薯淀粉和葡萄糖的芽孢形成率相近,前者芽孢收获量略高,但培养时间约是后者的2倍。因此,兼顾芽孢量的收获和培养时间的缩短,葡萄糖是最适宜的C源。葡萄糖浓度对菌体生长和芽孢形成有影响,浓度低时,提高葡萄糖浓度能提高菌体量,芽孢形成几乎不受影响,过高的葡萄糖浓度抑制菌体的生长,降低芽孢形成率,因此,培养基最适宜的起始葡萄糖浓度为15g/l。 

    纳豆芽孢杆菌JS-NDT-05适宜有机氮源，芽孢形成率除酵母粉外均能达到98%。以无机氮为唯一氮源时, 纳豆芽孢杆菌生长弱，芽孢难以形成；以酵母膏为氮源时,芽孢数量最高,但从利用廉价工业副产品的角度，玉米浆粉、花生饼粉、大豆饼粉应是低成本、大规模培养芽孢的适宜氮源。NaCl是适宜菌体生长的无机盐, CaCO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、K2HPO4分别与之组成培养基的无机盐组分时,对菌体生长和芽孢形成的影响不同, 添加KH2PO4后,活菌数、芽孢数量和芽孢形成率均有所提高。Mn2+促进菌体生长，随着Mn2+的提高，纳豆芽孢杆菌的营养活菌数随之提高，但对芽孢形成来说,低浓度Mn2+不影响芽孢形成率，当浓度超过7.1mmol/l时则显著抑制芽孢形成，Mn2+浓度为2.4mmol/l时对芽孢形成率和活菌数均有利。 

   对于培养基的起始pH值来说,在6.0～8.5的考察范围内，菌体生长和芽孢形成对pH值的要求有所不同，7.0～7.5是适宜生长的pH值范围，6.5～7.0则是适宜芽孢形成的pH范围。因此，为了在提高菌体量的同时提高芽孢数量，pH值7.0最适宜。在接种后起始芽孢数104～107个/ml的实验考察范围内,接种量的提高有利于芽孢数量的提高,但接种后芽孢的倍增率则下降了，芽孢接种量在106数量级可取得最佳的平衡。 

    纳豆芽孢杆菌是好氧菌,溶氧是菌体生长和芽孢形成的重要因素。摇瓶实验结果显示,通气量大有利于菌体生长,提高芽孢形成率,有利于芽孢活性的保持。在15L自动发酵罐中对培养过程进行观察,结果显示,在对数生长期菌体快速生长,供氧速度跟不上耗氧速度,导致菌体处于厌氧生长状态,不仅减缓了生长速度，延后芽孢的形成,而且也不利于活菌数和芽孢数量的提高，在培养过程中,控制溶氧水平,则能显著改善这一状况,提高芽孢收获量,缩短培养时间。