细胞培养基的灭菌方法

摘要：培养基的灭菌方法主要有两种，高压除菌及过滤除菌。与过滤相比，高压灭菌的工作强度小，成本较低，但易造成营养成分的流失，而且在多次加样（无菌谷氨酰胺溶液，无菌碳酸氢钠溶液等）过程中容易造成二次污染。

大多数培养基采用0.1～0.2μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌，并且已成为培养基除菌的发展方向，它可低限度地减少培养基的营养损失。

1、高压灭菌

某些培养基（如MEM）可进行高压灭菌，例如清大天一的MEM培养基中的MD605、MD609等。这类培养基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，一般是在培养基高压灭菌后加入L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的无菌的液体。另外可用耐高压的谷氨酸盐（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺。可高压灭菌的培养基在121℃、15psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，不需将灭菌时间延长。为保证高压灭菌的效果，灭菌设备的验证很关键。

2、过滤除菌

目前培养工作中采用的培养用液包括人工合成培养液、消化用酶等，常含有维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用过滤消毒以除去细菌。可供过滤灭菌使用的滤膜很多，其材料多为polyethersulphone（PES）、尼龙、多聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等。目前常用的滤器有Zeiss滤器、玻璃漏斗式滤器和针式微孔滤器。

其中，Zeiss滤器为不锈钢的金属结构，中间夹有一层石棉制成的一次性纤维滤板。滤板具有一定的厚度，可承受一定的压力，因此是过滤粘稠液体较理想的滤器。滤板有不同的规格，进口的型号为EKS，EKS2，EKS3等。国产的有甲1、甲2、甲3等，其中以EKS3及甲3过滤除菌的效果较好，但因孔径很小，过滤速度较慢。Zeiss滤器可分为抽滤式或加压式抽滤式滤器与抽滤瓶相连，真空泵抽气形成负压以过滤液体，其效率不如加压式。由于抽气造成负压抽吸，操作使用时要防止倒流而引起污染，因此要注意避免将出、入管道接错；停止抽气时应使用气体缓慢回流，要先用止血钳夹住抽气管再关机，防止气体回流。加压式滤器的容器为密闭式，加入待过滤的液体后，通以气体（常用N2、O2），形成压力将液体滤过，效果较佳。使用时注意压力不能过大，不应超过0.2kg/cm2。另外，由于使用的滤板为石棉，滤过的液体内有时可能混有少许杂质，因此在过滤前应先以少量生理盐水湿润滤板。Zeiss滤器的清洗比玻璃滤器简单，滤板属一次性，使用后即可弃去，以自来水将金属滤器初步冲洗，用洗涤剂刷洗干净，自来水冲净，蒸馏水漂洗2-3次，晾干包装。消毒前将滤板装好，旋钮不要拧得太紧，消毒后立即将旋钮拧紧以保证过滤除菌的效果。此外，也可在石棉滤板上加一层滤膜，以增加过滤效果。

玻璃滤器为玻璃结构，以烧结玻璃为滤板固定于玻璃漏斗上，可用于过滤各种培养液体。只能采用抽滤式。根据滤板孔径的大小分为G1-G6六种规格型号，其中只有C5及C6可用以过滤除菌，一般都使用C6型，但过滤速度较慢。玻璃滤器的使用方法与抽滤式Zeiss滤器相同，但清洗过程比较繁琐。玻璃滤器使用后及时用自来水冲洗滤器表面的剩余物，然后用单蒸水浸泡，除去滤板内堵塞杂物，若用滤膜则将滤膜丢弃，加4N盐酸浸泡12小时以上，用自来水冲洗，再用单蒸水抽滤2次，双蒸水（或去离子水）抽滤冲洗、包装、121℃高压蒸汽灭菌20分钟。也可用5%的洁消精浸泡20分钟后，再按上述方法冲洗和灭菌。

微孔滤膜滤器的基本结构与Zeiss滤器相同，为金属结构，其中间为一种一次性的特制混合纤维素脂滤膜，可用于各种培养液体的过滤除菌，速度较快。效果较好，现已为许多实验室所使用。滤膜的规格很多，主要根据滤器的直径大小而划分型号，可接待过滤液体的量来选择适当的型号。滤过大量培养液时，一般多用直径10cm（容器量为500ml）及直径15cm（容器量为2000ml）两种规格。用于小量培养液时，可选用2.5cm直径滤器，以注射器推动压力而过滤。滤膜的选择是效果好坏的关键。有孔径为0.6、0.45、0.22um三种滤膜，用以过滤除菌时，最好使用0.22um孔径的滤膜（可以除去细菌和霉菌）。由于滤膜很薄，在滤器的上层和下层的相应部位各有一凹槽以放置一硅胶垫圈来固定、压紧滤膜。安装滤膜时要注意，滤膜薄而且光滑，容易移动。千万不能装偏而是过滤失败；同时要注意滤膜的正反面，正面（光面）应向上。由于滤膜薄，承受压力有限，力量不能过大、过猛，以免滤膜破裂。大量培养液过滤通常装上两张膜，上面为0.45um，下面为0.22um。每次过滤完毕应打开滤器，核实滤膜是否摇动或破裂，以保证有效过滤除菌。微孔滤膜滤器的清洗、消毒方法和Zeiss滤器相同，滤膜使用后即丢弃。