脂环酸芽孢杆菌抗原制备

摘要：采用已建立的间接 ELISA 法分别测定 3F7 和 9C4 各吸收峰的纯化产物，并与纯化前的腹水、50%饱 和(NH4)2SO4 沉淀和 45%饱 和 (NH4)2SO4 沉淀的蛋白效价进行比较。将纯化后腹水中 McAb 进行亲和常数的测定。

免疫用抗原制备：参考文献的方法培养 A. acidoterrestris (ATCC49025)，重复洗涤 2 次后，用生理盐水将该菌的浓度调整到 109 CFU/mL。

包被用抗原制备：取部分洗脱好的菌液用超声波粉碎仪进行裂解。以 20 kHz 频率、150 W 的功率在冰浴中将细菌细胞破碎，每 6 s 间隔 4 s，总共时间为 30 min。裂解后将液体 3 000 r/min 离心 10 min，将上清与沉淀分别用 Eppendorf 管进行分装，存于−20 °C。

筛选方法采用间接 ELISA，用方阵滴度法确定抗原包被浓度和酶稀释度。抗原分别做 1:1 000、 1:2 000、1:4 000 的稀释；酶标分别做 1:20 000、 1:40 000 的稀释；免疫小鼠多抗血清用样品稀释液从 40×起倍比稀释；HRP 标记的羊抗小鼠 IgG，用酶稀释液分别做 1:20 000、1:40 000 稀释；设阴性和空白对照；以 450 nm 波长，以空白对照调零，读记各孔光密度值(OD)，凡P/N>2为阳性结果(P/N= 待测孔 OD 值/阴性对照孔 OD 值)。

取 5 只 6−8 周龄体重 18 g 左右雌性的健康 BALB/c 小鼠，免疫前 7 天卡介苗致敏小鼠 (0.1 mL/每只)。每次免疫间隔 3 周，都较前一次免疫剂量加倍，共 3 次。于第 3 次免疫 7 d 后以间接ELISA 法检测小鼠抗体效价，取效价最高的小鼠脾脏进行细胞融合。确定的抗原包被浓度包被酶标板，将免疫小鼠全血按照 100×、200×、 400×−51 200×稀释，即倍比稀释的方法进行间接 ELISA 法检测。

对冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)进行复苏，用含 20%胎牛血清的 DMEM 完全培养液进行传代培养，且加入 1% 8-氮鸟嘌呤进行处理，细胞处于对数生长期时即可用于细胞融合。制备饲养层细胞、免疫鼠脾细胞悬液，与骨髓瘤细胞进行细胞融合。

当融合细胞覆盖孔底 20%−30%时，用间接 ELISA 法对细胞培养上清进行检测，对挑选出的阳性孔及时采用有限稀释法进行克隆。每次克隆后第 9 天左右，对克隆过的细胞上清用 ELISA 进行检测，对所得的 OD450和对应的克隆数进行评价。选择克隆数少、OD450 高的阳性孔，将其再次克隆。经 3−4 次克隆，直到阳性率 100%。将细胞株转入 24 孔细胞培养板中继续生长，待其适应后再转入细胞瓶中。细胞数量足够多时收集细胞进行小鼠腹水的制备。

取 8−10 周龄 BALB/c 小鼠，每只小鼠腹腔注射 0.5 mL高压灭菌后的液体石蜡。7 d 后腹腔注入 1×106 −5×106 个杂交瘤细胞。小鼠腹部明显膨大时，无菌操作收集腹水，1 000 r/min 离心10 min 收集中间层液体即为单克隆抗体，−20 °C 冻存备用。离心沉淀物用生理盐水悬浮后按 1×106 −5×106 个细胞/只注射小鼠，继续进行腹水的扩大化生产，将传代过程中生长良好的细胞移入2 mL冻存管于液氮罐中冻存。

用间接 ELISA 方法对单克隆抗体细胞培养液上清和腹水进行效价测定，亚类鉴定采用 Sigma 公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定，杂交瘤细胞的染色体鉴定按照文献进行。测定杂交瘤细胞在第1次到第4次克隆的 OD450。同时测定小鼠第 1、 2、3、4 代腹水的效价，并将这些结果进行比较。

用 ELISA 叠加试验进行抗原位点分析(腹水和细胞上清)，在确定各 McAb 饱和值的基础上，在最适菌体抗原包被的酶标板内分别加入一种饱和浓度 McAb1 (100 µL/孔)，37 °C 作用 30 min，洗涤 4 次后加入另一种饱和浓度的 McAb2 (100 µL/孔)，同样孵育洗涤；加入 1:1 000 稀释的羊抗小鼠 IgG-HRP (50 µL/孔)，同样孵育洗涤；加入 TMB 底物溶液(100 µL/孔)显色 10 min，2 mol/L H2SO4 终止反应，测定 OD450 值，计算叠加率(AI)。按如下公式计算：AI=[2×A(1+2)÷(A1+A2)−1]×100%。公式中： A1为 McAb1 的 OD450值；A2为 McAb2 的 OD450值； A(1+2)为 McAb1 叠加 McAb2 的 OD450值。AI >50% 说明被测的两株单抗的抗原结合位点不同；AI<50% 说明被测的两株单抗抗原结合位点相同；且 AI 值越大，抗原位点重叠的可能性越小。