大肠杆菌合成甘露醇实验结果

1. 蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶共表达体系的构建及鉴定

    分别以植物乳杆菌和布氏乳杆菌 DNA 为模板，按照 1.2.2 方法用引物 P1、P2、P3、P4 分别进行 PCR 扩增。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测发现，在 1.5 kb 和 1.0 kb 附近分别有特异性的单一 DNA 条带与目的基因片段大小一致。将 PCR 产物与pMD19-T Simple Vector 连接后委托北京华大基因有限公司进行测序，经过比对，PCR 产物与 GenBank 中的 sacA 和 mdh 基因序列一致。将扩增出的蔗糖水解酶基因(1 502 bp，Sucrose hydrolase)和甘露醇脱氢酶基因(1 032 bp，Mannitol dehydrogenase)片段插入到表达载体 pET28a(+)上，生成质粒 pET28a-sacA-mdh ，重组质粒 pET28a-sacA-mdh 经 BamHⅠ和 Hind Ⅲ双酶切鉴定，小片段为 2 500 bp 左右目的基因，大片段为 5 500 bp 左右的 pET-28a(+)载体，以及进行了 PCR 验证(图 2)，均验证正确，表明目的基因已插入到 pET-28a(+)载体上。

2. 目的蛋白的表达及酶活分析

    将重组菌BL21(DE3)/pET28a-sacA-mdh与对照菌 BL21(DE3)/pET-28a 在 37 °C 摇床过夜培养，按 1%的接种量转接于 50 mL 含卡那霉素的液体培养基中，37 °C、200 r/min 摇床振荡培养，当菌体密度 OD600 达到 0.6−0.8 之间时，加入 IPTG (终浓度为 0.1 mmol/L)，25 °C 继续培养 6 h，离心收集菌体沉淀，悬浮于乙酸钠缓冲液(pH 5.3)中，超声处理破碎细胞。破碎后悬浮液 6 000 r/min 离心 10 min，收集上清液，经 SDS-PAGE 分析结果。由图 3 可知，与对照菌株相比较，BL21(DE3)/pET28a-sacA-mdh菌株在 55.1 kD 和 37.8 kD 附近出现两条明显的特异蛋白带，两条带的大小与预测一致。说明 sacA 和 mdh 在大肠杆菌中获得了成功表达。同时对重组菌株 pET28a-sacA-mdh/BL21 的产酶情况进行了分析，蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶酶活达到 25.78 U/mL 和 14.56 U/mL。

3. 利用HPLC法和质谱检测甘露醇

    HPLC 法进行甘露醇产量分析表明， BL21(DE3)/pET28a-sacA-mdh 作为酶源在整个发酵体系中可以与底物蔗糖反应生成甘露醇，产量达到 37.13 g/L。而对照组反应体系中，底物的量几乎没有变化，且没有预期产物的生成。基本可以判定构建的基因工程菌可以作用于底物蔗糖并生成甘露醇。为了进一步确定所生成的产物是甘露醇，我们应用 LC-MS 对发酵产物进行质谱分析。分析结果如图 4 所示，根据甘露醇的结构及分子量，设置扫描质量范围为 100−500，在负离子模式下，得到发酵液中产物的离子峰为 m/z：205.0 (M-Na)，与甘露醇标准品完全一致。

4. 重组菌合成甘露醇发酵条件的优化

    4.1 发酵时间对甘露醇产量的影响：由于 IPTG 对菌体有一定的毒性，添加浓度过大会抑制细菌的生长，影响产物的合成。当菌体的浓度 OD600 达到 0.8 左右时，添加 0.1 mmol/L 的 IPTG，使产量最佳。确定了最佳诱导时机后，对产物的发酵时间进行进一步确定。如图 5 所示，在菌体浓度达到 OD600 为 0.789 时加入一定浓度的诱导剂，诱导 10 h 后，产物已接近峰值，虽然随着发酵时间的延长，产量仍有所增加，但幅度明显变小，而且长时间的发酵不仅浪费能源，同时也会造成副产物的积累和产物甘露醇的损失，故确定最佳诱导时间为 10 h，产量可达 38.34 g/L，与乳酸菌发酵生产甘露醇相比，大大缩短了发酵时间。

    4.2 pH 对甘露醇产量的影响：发酵培养基初始 pH 对甘露醇产量的影响结果如图 6 所示，初始 pH 过低时，抑制了菌体的生长代谢，从而对底物的利用率降低，因此甘露醇产量明显减少。当初始 pH 较高时，菌体的生长代谢相对旺盛，更多的底物进入磷酸戊糖代谢途径转化为乳酸和乙酸，其中由蔗糖代谢产生的果糖可能更多的进入能量代谢途径，而没有转化为甘露醇，致使甘露醇的产量有所减少。因此我们选择初始 pH 6.0 作为发酵蔗糖产甘露醇的最优初始值。

    4.3 底物浓度对甘露醇产量的影响：不同底物浓度对甘露醇产量的影响结果如图 7 所示。从图 7 中可以看出，随着糖总浓度的增加，甘露醇的浓度并没有相应的增大，在糖总浓度为 120 g/L 时，获得最大甘露醇的积累。糖总浓度增加，发酵培养基中的总碳源和底物量增加，一般来讲，对菌体的生长是有利的，但是糖浓度过高，会对菌体的生长产生抑制作用，从而影响甘露醇的产量。蔗糖会在蔗糖水解酶的作用下生成等量的果糖和葡萄糖，只有果糖会转化成甘露醇，葡萄糖只是用来大量、迅速的繁殖菌体，当糖浓度过高时，菌体生长到一定时期会停止生长，会有大量的葡萄糖剩余，从而影响甘露醇的转化率。因此，综合甘露醇产量及转化率考虑，选择糖浓度为 120 g/L 时最佳，甘露醇含量为 42.66 g/L，转化率为 35.55%。 

    4.4 底物添加方式对甘露醇产量的影响：分批培养时，在菌体的生长稳定期剩余葡萄糖、蔗糖浓度均较高，说明初始蔗糖浓度可适当降低，以提高转化效率。采用方法 A 进行发酵实验，在发酵开始一次性添加蔗糖浓度达到 120 g/L，发酵结束后甘图 7 底物浓度对甘露醇产量的影响 Figure 7 Effect of substrate concentration of mannitol production 露醇产量仅为 41.17 g/L，说明初始蔗糖浓度过高有可能对菌的生长产生抑制，为此我们采取分批补加蔗糖的方式进行发酵生产甘露醇，由图 8 可以看出，采用方法 B、C、D 3 种方式进行实验，初始蔗糖浓度越低，菌体生长越旺盛，甘露醇产量越高，蔗糖的添加方式可以采用“按需添加”。实验结果表明，分 3 次补加蔗糖，菌体生长最旺盛且甘露醇产量最高，说明菌体的生长与甘露醇的合成呈现正相关性，若能延长对数生长期，可以提高菌体量和甘露醇产量。因此，维持发酵过程中蔗糖浓度在 40 g/L 左右是有利于甘露醇合成的最佳浓度，产量可达 45.19 g/L，转化率为 37.66%，而利用野生型布氏乳杆菌，以蔗糖为底物，尽管优化了发酵条件，生成甘露醇的产量也仅有 7.63 g/L，与其相比，甘露醇产量提高了 6 倍，更有利于甘露醇的工业化生产。