大肠杆菌合成甘露醇的机制是什么？

    摘 要：【目的】异型发酵乳酸菌可利用胞内产生的甘露醇脱氢酶将果糖高效转化为甘露醇，但果糖作为底物相对昂贵，不利于工业化生产。为了降低生产成本，必须选择廉价的底物。蔗糖相对便宜，并且大量存在于自然界中，能够被重组大肠杆菌利用产生甘露醇。蔗糖水解酶 (Sucrose hydrolase)和甘露醇脱氢酶(Mannitol dehydrogenase)是发酵生产甘露醇中催化蔗糖转化成甘露醇的关键酶，构建蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶共表达菌株并进行相关研究是本文的主旨。

    【方法】利用 PCR 方法分别从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和布氏乳杆菌 (Lactobacillus buchneri)基因组 DNA 中获得 sacA 和 mdh 基因，得到大小分别为 1 502 bp 和 1 032 bp 的目的基因，经序列分析后将其连接到表达载体 pET-28a(+)上，得到重组表达载体 pET28a-sacA-mdh。将重组质粒转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中，并用 SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达情况并测定其酶活。】

    【结果】SDS-PAGE 显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为 55.1 kD 和 37.8 kD，与预期分子量一致，实现 sacA 和 mdh 基因的表达。蔗糖水解酶和甘露醇脱氢酶酶活分别为 25.78 U/mL 和 14.56 U/mL。对重组菌株 BL21(DE3)/pET28a-sacA-mdh 进行发酵条件优化，甘露醇质量浓度达到 45.19 g/L，总糖转化率为 37.66%。

    【结论】与乳酸菌利用蔗糖发酵生产甘露醇相比，产量提高了 6 倍，且具有发酵周期短、稳定性高等优点，菌株的成功构建为甘露醇工业化生产奠定了基础。

    甘露醇是一种天然的六碳糖醇，具有甜度适宜、热量低、无毒副作用等特性，被广泛应用于医药、食品、化工等领域。目前国内甘露醇的生产方法主要有两种：天然提取法和化学催化法。化学催化法将果糖转化成甘露醇和山梨醇，由于产率较低，且有大量副产物山梨醇的产生，给甘露醇的分离纯化带来了困难。采用生物转化制备甘露醇主要是以果糖为底物，在甘露醇脱氢酶的作用下生成甘露醇，具有反应选择性高、反应条件温和、不副产山梨醇、且收率高等优点，故而微生物转化法将成为甘露醇生产的主要趋势。

    乳酸菌，尤其是异型乳酸菌的甘露醇脱氢酶更易于转化果糖生成甘露醇，但果糖作为底物相对昂贵，蔗糖相对便宜，能够被微生物利用产生甘露醇更具有生产前景。 2006 年，Saha研究了以 Lactobacillus intermedius NRRL B-3693 为发酵菌株，利用糖蜜和果糖糖浆的混合物(总糖浓度为 150 g/L；果糖：葡萄糖为 4:1) 生产甘露醇，产量可达 104 g/L。Korakli 等和 Niklas von W.都分离或筛选出可高产甘露醇的乳酸菌，采用的碳源多为果糖-葡萄糖混合物或糖蜜-果糖浆混合液，产量较高，但均含有果糖的参与，且发酵周期较长，导致生产成本较高，不利于工业化生产。2010 年，金红星等以蔗糖为原料用明串珠菌发酵生产甘露醇，但是甘露醇产量仅有 7.31 g/L。2009 年，王芳将甘露醇脱氢酶在大肠杆菌中克隆及表达，以果糖为底物，果糖既用于能量代谢又用于甘露醇的转化，转化率较低。

    因此，寻找廉价的底物进行生物转化生产甘露醇，是当今面临的主要问题。蔗糖是质优价廉的原料，分解后主要产生果糖基，对于那些经由果糖转化得到目的产物的生产工艺来说是优选的底物。因此，有效利用蔗糖中的聚合果糖和大肠杆菌的细胞工厂生物转化生产甘露醇，无疑是比较可行的路线之一。当前，随着基因工程技术的迅速发展，通过合成甘露醇生产过程所需的多种酶来大量合成甘露醇已成为可能。

    本研究利用 PCR 方法从植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum) 和布氏乳杆菌 (Lactobacillus buchneri)基因组 DNA 中获得蔗糖水解酶(sacA)基因和甘露醇脱氢酶(mdh)基因，将 sacA 和 mdh 串联到表达载体 pET28a(+)上，转化大肠杆菌，构建重组大肠杆菌 BL21(DE3)/pET28asacA-mdh，利用蔗糖为底物合成甘露醇。在发酵中，蔗糖在蔗糖水解酶作用下生成等量的葡萄糖和果糖，葡萄糖用于能量代谢，而果糖可以在代谢中更多的转化为甘露醇，从而提高了甘露醇的转化率。而且利用大肠杆菌发酵生产甘露醇，具有发酵周期短、稳定性高等优点。