食源性致病菌大肠杆菌O157:H7如何检测？

    【摘要】目前，病原微生物污染防控是食品安全的刚性需求，微生物污染是食品不合格的主要原因，也是造成食物中毒的主要原因，尤其以细菌性食物中毒为主，食品中大肠杆菌污染率最高达到了41.1%，大肠杆菌O157则为3.7%。肠出血性大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌(EHEC)的一个血清型，是引起食源性疾病主要血清型，主要临床症状为突发性腹痛、腹泻、血便，严重时并发肾衰竭，病死率高。大肠杆菌O157:H7主要污染肉类食品，蔬菜中也时有检出，是食品中潜在危害巨大的食源性致病菌。因此，快速、特性、高效的检出食品中大肠杆菌O157:H7，对于其引起的食源性疾病防控以及暴露病例的治疗具有重要的意义。本文比较了MicroFast快速增菌培养基（简称MF培养基）、改良EC肉汤培养基（简称：mEC+n）和FP培养基对大肠杆菌O157:H7的增菌效果，以期验证不同培养基的增菌优势和特异性，为探索省时、高效、特异的快速检测方法提供依据。

 材料与方法

 1.菌种

     大肠埃希氏菌O157:H7（ATCC12478）为实验用标准阳性菌株。

     大肠杆菌、ATCC25922/8739、CMCC44102/44103（Escherichia coli）、肠杆菌 ATCC14028/ 43864/49027（Enterobacteria），沙门氏菌 CICC21482  CMCC 50333/50220/50115/ 50335（Salmonella），李斯特氏菌 ATCC19115、CMCC54002/22260（Listeria），假单胞菌ATCC 27853、CMCC10104（Pseudomonas），枯草芽孢杆菌ATCC 6633、CMCC63501（Bacillus subtilis），为特异性检测用菌株。

 2. 培养基

     MicroFast快速增菌培养基，简称MF培养基，北京良润生物科技有限公司；改良EC肉汤培养基，简称为mEC+n培养基，按照GB 4789.36-2008规定步骤配置，备用；FP培养基，国外某品牌培养基。

 3. 仪器设备

     紫外可见分光光度计（UV-2450），日本岛津；隔水式电热恒温培养箱（GHP-9270），金坛市城东久久实验仪器厂；净化工作台（YJ-875），吴江市华都净化设备公司；自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40C1），上海申安医疗器械厂；电子天平（BSA323S），北京赛多利斯。

 4. 方法

 4.1 培养基的制备

     按照说明书或者GB 4789规定的要求和步骤进行，按照需要制作液体培养基和固体培养基。

 4.2 菌株修复

     将阳性标准菌株进行制备热损伤和冷损伤。热损伤菌体制备：将标准阳性菌株的菌悬液（108~109cfu/mL）置于55℃水浴锅、加热15min后取出，室温冷却30min，定义为热损伤菌体细胞，备用。冷损伤菌体制备：将菌悬液置于-20℃冰箱、冷冻2h，然后取出室温预热30min，定义为冷损伤菌体细胞，备用；正常对照组：未做处理的菌悬液，定义为正常组菌体细胞。将相同浓度的大肠埃希氏菌O157菌悬液菌，分别按照上述规定的方法进行菌体损伤处理，36±1℃、培养8h后，稀释进行平板计数，每组做5个平行，取平均值。

 4.3 生长速度

     吸取0.2mL大肠埃希氏菌O157 NCTC12900的菌悬液（108~109cfu/mL），按照2%的接种量，分别接种到盛有10mL MF培养基、mEC+n培养基和FP培养基的18×180mm试管中，每组10支试管，36±1℃培养，每隔1h测定其OD600吸光度值，每只试管测3次，取平均值绘制其生长曲线。同时通过平板计数法计数对数期各时间点的菌落形成单位数，计算倍增时间。

 4.4 特异性

     无菌吸取0.2mL对照标准菌株菌悬液（108~109cfu/mL），接种于盛有10mL不同培养基中，36±1℃、培养18h，观察培养管的浑浊程度，统计结果。